抗微管药物的最新研究进展
美国创力微管研究中心
微管是（microtubules）真核细胞普遍存在的一种纤维结构，是细胞骨架的主要成分之一。由位于细胞核旁的中心体（微管组织中心）生长出的微管向四周辐射分布达细胞膜，或由纤毛、鞭毛基部的基粒（微管组织中心的一种）发出的微管组成纤毛、鞭毛的轴线。不同类型的细胞中微管具有相同的形态，大多数微管见于细胞质基质内，是纤毛、鞭毛等运动性器官和中心粒的组成部分。微管是直径25纳米的中空管状纤维，由微管蛋白和少量微管结合蛋白的聚合作用而形成的。微管蛋白具有α和β两型，α和β微管蛋白形成二聚体。微管是由二聚体组成的13条原纤维装配成的。最近发现还存在γ型微管蛋白，主要定位于中心体，其功能与组装微管有关。微管对维持细胞形态、细胞运动、细胞内物质运输、细胞分泌、染色体运动等许多细胞功能具有重要作用。
美用叶酸提高微管肿瘤靶向性（摘自中国医药报）
美国斯坦福大学的科学家们日前发现，外层涂有叶酸分子的碳微管能够准确“发现”并破坏肿瘤组织。
微管可作为一种载体，输送治疗性DNA、RNA或蛋白分子，直接进入细胞核中治疗传染性疾病或其他疾病。该大学的研究人员将涂层微管分别导入正常的和癌变细胞的培养器中。因为癌细胞膜中富含叶酸受体，这些微管首先会被恶性组织所吸收。随后，研究人员用近红外线照射，这种照射对正常的组织无害，但能迅速的使微管加热破坏癌细胞。目前，他们用另一种实验来继续研究，在这项实验中，他们将碳微管连接到癌抗体中来治疗淋巴瘤小鼠。
桔青霉No.68菌株的发酵产物对微管作用的研究
张克 张月琴 魏玉珍 司书毅 李毅 甄永苏
摘要：在寻找作用于微管的微生物活性代谢产物的过程中，发现从东北红豆杉内皮层中分离到的一株桔青霉菌No.68的发酵液能将细胞有丝分裂阻断在中期。通过免疫荧光试验和电镜观察，证明发酵液中含有作用于微管的活性物质，且其作用效果为抑制微管聚合。
关键词：微管； 青霉； 有丝分裂
中图分类号：R979.1 文献标识码：A
文章编号：1001-8689(2000)04-0250-03
Study on the anti-microtubule activity of the fermentation
product of a Penicillium strain
Zhang Ke， Zhang Yue-qin， Wei Yu-zhen， Si Shu-yi，
Li Yi and Zhen Yong-su
(Institute of Medicinal Biotechnology, Peking Union Medical College，
Chinese Academy of Medical Sciences， Beijing 100050)
ABSTRACT During the course of searching for microbial active metablites targeting microtubules, the fermentation broth of strain No.68, isolated from the inner bark of Taxus cuspidata Sieb.et Zucc., was found to induce metaphase arrest in vitro. Indirect immunofluorescence and electron microscopy studies show that strain No.68 can produce anti-microtubule agents, and the active composition can inhibit the polymerization of the microtubules.
KEY WORDS Microtubules； Penicillium； Mitosis
随着对taxol(紫三醇)作用机理的深入研究，作用于微管的抗肿瘤药已引起广泛的重视。抗微管药干扰了纺缍体的形成，从而使肿瘤细胞停止在有丝分裂中期。1993年，美国科学家Stierle等首次从一株寄生于太平洋红豆杉树皮内的真菌Taxomyces andreanae的发酵液中分离得到了taxol［1］，这一发现使人们对于从微生物中寻找作用于微管的抗肿瘤物质产生了极大的兴趣。我们从我国长白山地区的东北红豆杉树皮中分离到一株青霉No.68，其发酵液在体外细胞实验中能使肿瘤细胞停止在有丝分裂中期，有可能其内含有作用于微管的活性物质。我们通过免疫荧光试验和电镜观察，证明其内确实含有抑制微管聚合的活性物质。
1 材料和方法
1.1 细胞系 来源于人口腔鳞癌的KB细胞，用含有10%小牛血清的RPMI 1640培养液在含5% CO2的37℃温箱中培养。
1.2 细胞中期阻断分析 将药物作用后的KB细胞Giemsa染色，普通光镜下观察染色体的形态，计算被阻断在有丝分裂中期的细胞与间期细胞的比率［2］。
1.3 免疫荧光试验 将药物作用20h后的KB细胞经过固定等处理后，先后与一抗、二抗结合，方法主要参考文献［3］。一抗采用抗微管蛋白鼠抗体(Sigma公司)，二抗采用结合FITC的羊抗鼠抗体(Sigma公司)。然后在BHF型荧光显微镜下观察微管形态。
1.4 微管蛋白的制备 微管蛋白是将新鲜猪脑经过一定处理后，再经过两次解聚-聚合循环获得的［4］。将得到的微管蛋白于-70℃保存。
1.5 电镜试验 浓度约1～3g/L的微管蛋白在体外聚合条件下(MES buffer: MES 100mmol/L，EGTA 1mmol/L，2-ME 0.5mmol/L，GTP 1mmol/L，pH6.5)，与药物作用30min后，用负染法电镜观察形成的微管的超微结构［5］。
2 结果 No.68的发酵液作用KB细胞20h后，Giemsa染色可观察到约70%的细胞被抑制在中期(图1)。其特点为：核膜破裂，核仁消失，染色体浓缩，分散于整个细胞中。而对照组细胞约90%处于间期。
No.68菌株发酵液作用后KB细胞Giemsa染色结果(×400) |
细胞所指为:完整细胞内的策管 |
箭头所指为:(multipolar spindle) |
药物对微管聚合状态的影响通过免疫荧光法来观察(图2a～e)。对照细胞的微管延伸充满了整个细胞，在细胞周边可看到丝状微管结构(图2a)。低浓度taxol作用的细胞内有许多小亮点，这是低浓度taxol使细胞内出现的多极化纺缍体(multipolar spindle)(图2b)。高浓度taxol作用的细胞内有束状结构(bundle)出现，这是高浓度taxol致使的微管在细胞周边及核外围的聚集(图2c)［6］。VCR促进微管解聚，所以其作用的细胞内看不到微管结构(图2d)，No.68菌株发酵液作用后的细胞内也看不到微管结构(图2e)
箭头所指的是:(bundle)的结构 |
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间接免疫荧光法观察药物对KB细胞内微管聚合状态的影响 |
a：control；b：0.01mg/L taxol；c：0.1mg/L taxol；
d：0.01mg/L VCR； e：No.68发酵液
药物对微管蛋白体外聚合成微管的超微结构的影响通过电镜法来观察(图3a～e)。taxol可使组成微管的原纤维平行排列，形成片状(sheet)结构(图3b)［5］。低浓度VCR抑制微管的形成，视野内看不到微管结构(图3c)，高浓度VCR可使微管蛋白异常聚集，但形不成正常微管结构(图3d)［7］。No.68菌株的发酵液作用后的视野内看不到微管结构(图3e)。
a：control |
b：10mg/L taxol
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c：1mg/L VCR |
电镜观察各种药物对微管蛋白体外聚合成微管的超微结构的影响(×30000)
d：10mg/L VCR |
e：No.68发酵液 |
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